생명과학 및 합성생물학 분야에서 높은 친화력과 특이성을 모두 갖춘 소분자 결합 단백질을 설계하는 것은 바이오센싱 및 분자 스위치를 구현하는 데 있어 항상 중요한 과제였습니다. 과거에는 이러한 접근 방식이 주로 천연 단백질의 스크리닝 및 변형, 또는 기존 단백질 골격을 기반으로 한 물리적 모델링 설계에 의존했는데, 이는 활용성과 확장성에 한계가 있었습니다.

이를 고려하여,한국과학기술원(KAIST) 생명과학부 연구팀은 딥러닝 기반 단백질 구조 생성 및 서열 설계 방법을 활용하여 NTF2 유사 구조를 핵심 "범용 골격"으로 삼아 다양한 소분자 결합 단백질을 새롭게 설계했습니다.더 나아가, 연구팀은 이를 화학적 유도 이량체화(CID)와 유사한 센서로 변형시켰습니다. 스트레스 호르몬인 코르티솔을 선택적으로 인식할 수 있는 단백질을 설계하는 데 성공했고, 이를 기반으로 인공지능 바이오센서를 개발했습니다. 이 사례는 단백질 설계 자체를 넘어 실질적으로 측정 가능한 센서 기술로 나아가며, 단백질 설계 분야에서 오랫동안 난제로 남아 있던 소분자 인식 문제를 해결합니다.

"설계된 단백질 계열을 이용한 소분자 결합 및 감지"라는 제목의 관련 연구 결과는 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications)에 게재되었습니다.

연구 하이라이트:

* 인공지능을 활용하여 단백질을 처음부터 설계하고(de novo) 이를 기능성 바이오센서에 적용합니다.

기존 방법은 주로 천연 단백질을 찾거나 특정 기능을 변형하는 데 중점을 두는 반면, 본 연구에서는 인공지능 기반 설계를 통해 원하는 기능을 갖춘 단백질을 "맞춤 제작"합니다.

* 본 연구 결과는 질병 진단, 신약 개발, 환경 모니터링 등 다양한 분야에 폭넓게 적용될 수 있습니다.

서류 주소:
https://www.nature.com/articles/s41467-026-70953-8

더 많은 AI 프런티어 논문:
https://hyper.ai/papers

데이터셋: NTF2 백본 구축

디자인 목표를 달성하기 위해,연구진은 먼저 패밀리 수준의 "환각" 방법을 사용하여 NTF2 구조 세트(세트 1: 1,615개의 백본)를 생성한 다음 ProteinMPNN을 사용하여 이러한 백본의 서열을 재설계했습니다.AlphaFold 알고리즘을 사용하여 설계된 구조로 접힐 수 있는 단백질을 선별했습니다(세트 2: 3,230개의 백본). 또한, Rosetta 파라미터화를 사용하여 백본 구조를 생성하고, ProteinMPNN을 사용하여 서열을 설계한 후 AlphaFold를 사용하여 구조를 검증했습니다(세트 3: 6,838개의 백본). 아래 그림을 참조하십시오.

최종적으로, 스크리닝을 거쳐 연구진은 실험적 특성 분석을 위한 인코딩 올리고뉴클레오티드를 확보했는데, 여기에는 630개의 HCY 결합 단백질, 1,661개의 ROC 결합 단백질, 16,276개의 WRF 결합 단백질, 9,024개의 APX 결합 단백질, 19,390개의 IRI 결합 단백질, 그리고 7,573개의 OHP 결합 단백질이 포함됩니다.

다양한 포켓 구조를 가진 NTF2 단백질 계열 설계

NTF2 폴드는 세 개의 α-나선과 곡선형 6가닥 β-폴드 시트로 구성됩니다. 이 구조들은 함께 이 폴드 계열의 특징인 큰 내부 연결 포켓을 형성하며, 이는 아래 그림에 나타나 있습니다.

자연에서 나타나는 이러한 접힘의 다양성은 주로 길고 불규칙한 고리와 독특한 4차 구조에서 비롯되며, 이 두 가지 모두 결합된 포켓의 기하학적 구조와 기능에 영향을 미칩니다.본 연구의 목표는 다양한 소분자를 수용할 수 있도록 다양한 포켓 구조를 가진 NTF2 단백질 계열을 설계하는 동시에, 모듈성과 설계 가능성을 유지하기 위해 루프 영역을 최소화하는 것입니다.전체 설계 과정은 다음 다이어그램에 나와 있습니다.

연구진은 다양한 포켓 구조를 가진 10,000개 이상의 NTF2 설계 단백질을 얻은 후, RIFdock을 사용하여 화학적 특성과 구조가 다른 6개의 소분자를 이러한 골격의 중심 포켓에 배치했습니다. 이 소분자에는 스트레스 호르몬인 코르티솔(HCY), 항응고제인 와파린(WRF), 근육 이완제인 로쿠로늄 브로마이드(ROC), 항응고제인 아픽사반(APX), 항암제 이리노테칸에서 유래한 항종양 활성 분자인 SN-38(IRI), 그리고 호르몬인 17-α-하이드록시프로게스테론(OHP)이 포함됩니다.

극성 인터페이스를 구축하는 것은 단백질 설계, 특히 소분자 결합 단백질 설계에서 중요한 과제입니다. 이는 리간드의 극성 작용기와 상호작용할 수 있도록 내부 포켓에 극성 잔기를 도입하는 동시에 단백질의 전체적인 안정성을 유지해야 함을 의미합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 연구자들은 두 가지 전략을 사용했습니다.

방법 1 (RIFdock을 HBNets에 연결)

연구진은 HCY, WRF, ROC, APX 및 IRI를 1개의 백본에 연결하고 HBNet 잔기에 의해 매개되는 단백질-소분자 상호작용이 최소 하나 이상 포함되도록 요구했습니다. 그런 다음 자연 서열을 기반으로 하는 Rosetta 설계를 사용하여 설계를 최적화했는데, 이 설계는 NTF2 계열 단백질에서 파생된 위치별 점수 행렬을 사용하여 서열 설계에 편향을 주었습니다.

방법 2 (무제한 RIFdock)

OHP, APX 및 IRI는 제약 없는 RIFdock을 사용하여 세트 2와 3의 백본에 배치되었으며, 서열 설계는 LigandMPNN을 사용하여 수행되었습니다. LigandMPNN은 단백질-소분자 복합체 데이터에 특화하여 학습된 ProteinMPNN의 변형으로, 설계 과정에서 리간드의 존재를 명시적으로 고려할 수 있도록 합니다.

연구진은 스크리닝 설계 결과에서 Rosetta를 사용하여 단백질과 리간드 사이의 수소 결합 수, 결합 에너지(ddG) 및 접촉 분자 표면적(CMS)을 계산했습니다. 방법 2에서는 단일 서열 AlphaFold 예측 결과도 결합하여 목표 폴드 구조와 결합 부위를 동시에 재현할 수 있는 설계를 스크리닝했습니다(아래 그림 참조).

연구 결과 발표: NTF2 기반 소분자 결합 단백질은 바이오센서에 적용될 수 있습니다.

연구진은 본 연구에서 제안된 설계 전략의 효과성을 검증하기 위해 일련의 실험을 설계했습니다.

결합 단백질의 설계 및 구조적 특성 분석

설계된 소분자 결합 단백질의 정확성을 검증하기 위해, 코르티솔 결합 단백질 hcy129와 아픽사반 결합 단백질 apx1049, 두 단백질-리간드 복합체의 결정 구조를 분석했습니다. 특히, hcy129는 ProteinMPNN을 이용하여 표면을 재설계함으로써 결정성을 향상시켰고, 코르티솔 복합체와의 1.5 Å 고해상도 구조를 성공적으로 얻었습니다. 구조 정렬 결과, 전체적인 접힘 구조가 설계 모델과 매우 일치했으며, Cα RMSD는 1.1 Å였습니다(아래 그림 A). 주요 수소 결합 잔기와 리간드 입체 구조 또한 정확하게 일치하여(아래 그림 B), 사전 구축된 수소 결합 네트워크(HBNet)가 극성 상호작용의 정밀한 설계를 효과적으로 달성했음을 보여줍니다.

반면, apx1049-아픽사반 복합체의 결정 구조는 2.1 Å의 해상도를 보여 설계 모델과의 높은 일치도를 나타냈으며, 113개 잔기에 걸쳐 Cα RMSD는 0.6 Å에 불과했습니다(아래 그림 C). 단백질-리간드 상호작용은 핵심적인 수소 결합과 방향족 잔기 사이의 π–π 스태킹 상호작용을 포함하여 설계 모델과 거의 완벽하게 일치하며(아래 그림 D), 이를 통해 리간드 형태를 안정화하고 형태적으로 매우 상보적인 결합 포켓을 형성합니다. 이러한 결과는 본 설계 전략이 원자 수준에서 고정밀 단백질-리간드 계면 구축을 달성할 수 있음을 보여줍니다.

결합 단백질에 대한 특이성 평가 설계

설계된 단백질의 특이성을 평가하기 위해, 본 연구에서는 비특이적 결합 능력을 가진 알부민을 대조군으로 사용하여 6가지 결합 단백질과 6가지 리간드에 대한 체계적인 결합 실험을 수행했습니다. 그 결과, hcy129.1, iri807.1, apx1049와 같은 고친화성 단백질은 각각의 표적에 대해 우수한 특이성을 보인 반면, 알부민은 대부분의 리간드에 거의 결합하지 않는 것으로 나타나, 설계 전략의 효과성을 입증했습니다.

또한, 와파린(WRF) 시스템에서 알부민(KD 약 5.0 μM)의 결합 친화도는 설계된 단백질 wrf1071(KD 약 1.1 μM)의 결합 친화도와 유사하여, 고도로 소수성인 리간드에 대한 비특이적 결합이 여전히 어려운 과제임을 나타냅니다.

전반적으로 이 방법은 인식에 있어 일정 수준의 높은 특이성을 달성했지만, 구조적으로 유사한 분자를 구별하고 소수성 리간드에 대한 선택성을 향상시키는 데에는 여전히 최적화의 여지가 있습니다.

바이오센서 제작 (코르티솔 유도 이종이량체 설계 및 특성 분석)

코르티솔은 일반적으로 생리적 시료에서 낮은 나노몰 농도로 존재하지만, 혈장 코르티솔 수치가 38nM 이상이면 쿠싱 증후군과 같은 질병의 진단 기준으로 사용될 수 있습니다. 생체 감지를 위해 hcy129의 코르티솔 결합 친화도를 향상시키기 위해, 연구진은 단일점 포화 돌연변이(SSM) 실험에서 선별된 유리한 돌연변이를 기반으로 조합 돌연변이 라이브러리를 구축했습니다. 효모 디스플레이를 이용한 스크리닝을 수행한 결과, 아래 그림에서 볼 수 있듯이 결합 친화도가 크게 증가했습니다.

이후 연구진은 라이브러리에서 최적의 변이체를 선별하고, 이를 대장균에서 발현시킨 후 등온 적정 열량계(ITC)를 이용하여 특성을 분석했습니다. 이 변이체 hcy129.1의 KD는 68 nM로, 원래 설계보다 31배 높았습니다(아래 그림 C 참조). 구조 분석 결과, 향상된 친화도는 주로 코르티솔과의 더 강한 소수성 상호작용에서 비롯된 것으로 나타났습니다(아래 그림 D 참조).

이러한 기반 위에, 본 연구는 코르티솔 의존성 이종이량체 시스템을 추가적으로 설계했습니다. hcy129.1의 구조를 변형하고 작은 단백질 골격을 도입하여 RIFdock, Rosetta, ProteinMPNN 등의 방법을 이용한 전산 설계 및 스크리닝을 수행했습니다. 최종적으로, hcy129.1 및 코르티솔과 삼중 복합체를 형성할 수 있는 작은 단백질인 miniH11을 얻었습니다.

실험 결과, 해당 시스템은 코르티솔이 존재할 때만 안정적인 복합체를 형성하는 것으로 나타났습니다. 더 나아가, 코르티솔 감지를 위해 나노비트 루시페라제 시스템과 결합하여 약 72 nM의 EC50 값을 검출하였으며(아래 그림 H 참조), 이는 결합 친화도와 일치하여 설계의 효과성을 입증했습니다. 동시에, 코르티솔이 없을 때는 시스템의 결합 친화도가 현저히 감소하여 이합체 형성 과정이 리간드에 대한 의존성이 우수함을 보여줍니다.

전반적인,본 연구는 NTF2 기반 소분자 결합 단백질을 기능성 바이오센서로 추가적으로 설계할 수 있음을 보여준다.

결론

종합적으로, 본 연구는 소분자 결합 단백질의 새로운 설계 경로를 제시합니다. 인공지능 모델을 사용하여 원자 수준에서 단백질-리간드 상호작용을 정밀하게 특성화함으로써, "천연 단백질을 발견하거나 변형하는 것"에서 "필요에 따라 기능성 단백질을 맞춤 제작하는 것"으로의 전환을 이루어내고, 실험 수준에서 효과적인 검증을 완료했습니다.

이는 단백질 설계 능력의 비약적인 발전을 의미할 뿐만 아니라, 질병 조기 진단에서의 바이오마커 정밀 검출부터 신약 개발에서의 표적 분자 인식, 환경 모니터링에서의 오염물질 실시간 감지에 이르기까지 응용 범위를 크게 확장합니다. 이 기술이 성숙해짐에 따라, 고도의 특이성과 프로그래밍 가능성을 갖춘 맞춤형 바이오센서는 생명과학과 실제 응용 분야를 연결하는 중요한 가교 역할을 할 것으로 기대됩니다.

참고문헌:
https://www.nature.com/articles/s41467-026-70953-8
https://phys.org/news/2026-04-ai-proteins-built-specific-compounds.html