スタンフォード大学医学部、9種の薬剤および2億1800万個の白血球に基づく単一細胞レベルのデジタルツインシステム「SIMCO」を発表、早産予防薬の開発を支援

早産（すなわち妊娠＜37週）は決して馴染みのない概念ではないが、多くの両親となる予定の人々は、赤ちゃんが予定より早く生まれて初めて、早産の高いリスクと深刻な害を真に認識するかもしれない。早産の発生は通常突然であり、前兆や既知のリスク要因がない場合でも起こり得る。また、早産は単に「赤ちゃんが少し早く生まれること」ではなく、妊娠週数が少ないほど、赤ちゃんの呼吸器系や神経系などの臓器の成熟度は自然と低くなり、克服すべき健康リスクのハードルは多くなる。

関連するデータ統計によると、世界中で10回の妊娠のうち1回は早産が発生している。さらに憂慮すべきことに、現時点でも早産は5歳未満の子どもの死亡原因の第1位である。

しかし幸いなことに、早産は予測不可能・介入不可能ではない。現在の研究では、早産の誘因は複雑であるものの、6割以上の早産が自然早産発症（spontaneous preterm labor、sPTL）であり、この種の早産の発生は母体の妊娠中の免疫調節のバランス異常と密接に関連しているため、免疫を標的にした制御や分娩開始タイミングへの介入が極めて重要である。しかし現段階では、妊娠期の臨床検証は倫理的・経済的な二重の制約を受けており、予防策の大規模な検証を実施することは極めて困難である。

この課題に対し、Stanford Medicineが主導するチームは、Simulated Immunome Modeling of Clinical Outcomes（SIMCO）という、AI駆動の単一細胞レベルのデジタルツインシステムを開発した。このシステムは母体の免疫系をシミュレートし、早産予防薬のテストに使用される——すなわち、妊婦に直接薬を試させるのではなく、デジタルツインによる仮想テストで複数の薬物組み合わせを評価し、sPTL予防策の大規模な検証を可能にする。 さらに、この手法は将来の臨床試験において、特定の症例に対する個別化された治療方針の指針を提供することが期待されている。

関連する研究成果は「Single-cell–level digital twins for preterm birth prevention strategies」という題名で、Science Advancesに掲載された。

研究ハイライト：

• 単一細胞分解能を持つ免疫デジタルツインシステムSIMCOを構築し、妊娠期の臨床試験の難局を打開

• 早産予防の可能性がある候補薬および併用療法をスクリーニングし、細胞分子メカニズムを解明

• 最適輸送学習モデルを産科免疫学に応用し、将来の精密な個別化早産予防に向けた新たな計算パラダイムを提供

論文リンク：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aed2741

大規模かつ網羅的な単一細胞体外薬物撹乱データセットの構築

訓練セット：単一細胞撹乱質量分析フローサイトメトリーアトラスデータセット（mass cytometry single-cell perturbation atlas）

従来の手法では、単一細胞分解能が欠如しているため、既存のモデルは細胞タイプ特異的なメカニズムやオフターゲット効果を検出しにくく、個別化介入策の設計も阻まれていた。この難題を解決するため、研究者らはSIMCOモデルの訓練用に単一細胞撹乱質量分析フローサイトメトリーアトラスを特に生成した。

具体的には（以下の図／表に示す通り）、研究では8名の非妊娠（月経周期第1週以内）ボランティアと11名の妊娠中期（妊娠20+0週から27+7週）ボランティアを募集し、多重薬物スクリーニング検査を実施して、9種の候補薬（chlorthalidone、maprotiline、metformin、lansoprazole、pravastatin、rifabutin、salicylic acid（SA）、SA+lansoprazole（SALPZ）、5-methyltetrahydrofolate（THF））のsPTL予防における免疫調節作用を評価した。

なお、本試験は米国カリフォルニア州スタンフォード市のスタンフォード病院で実施され、IRBの承認を得ている（プロトコル番号68417）。すべてのボランティアは18歳から45歳の女性で、BMI＜40、かつ現在免疫調節治療を受けていない。妊娠中期をサンプリング時点としたのは、この時期が妊娠維持期であり、分娩前の炎症経路が徐々に活性化される前であるため、候補薬が妊婦の免疫群に与え得る潜在的な影響を捉えやすいからである。非妊娠対照群のサンプルは月経周期早期に採取されており、この時期は初期卵胞期であり、低ホルモン状態を反映している。

各候補薬について、経口投与後に血液中で優位となる化合物形態を選択し、一部の薬物では対応する活性代謝物（THFやSAなど）を用いた。実験濃度は標準的な経口投与量に対応する体内血漿濃度を基準に設定した。以下の表に示す通りである：

スクリーニング試験では96種類の検出条件を設定し、各条件にはわずか100 μlの全血サンプルで済みます。実験処理は体内からの採血後30～60分以内に行われ、各条件ではLPS、IFN-α、IL-33、GM-CSF、TNFα、IL2/4/6混合物、PI、および無刺激対照の8種類の処理による薬物撹乱を同時に実施し、2時間共培養することで、生理状態に近い細胞タイプおよび刺激源特異的な免疫応答を検出します。

バッチバイアスを回避し、同時にバーコードの誤分配や細胞回収率を記録するため、本研究では新たに開発された9種類から4種類を選択するジプレット除去質量分析バーコード戦略を採用しました。Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110、Pt194、Pt195、Pt196、Au197の計9種類の同位素から4種類の組み合わせを選んでバーコードを生成し、合計126種類の利用可能なバーコードが得られ、そのうち純度が最も高い96種類を96の実験条件に対応させました。

同時に、質量分析フローサイトメトリーを用いた同期分析を行い、12種類の細胞内リン酸化タンパク質と8種類の活性化マーカーの発現変化を通じて、28種類の免疫細胞サブグループの機能応答を評価しました。最終的に構築された単一細胞撹乱マップには、80種類の撹乱条件と2億1800万個の白血球が含まれています。 各個人について、8種類の刺激×28種類の免疫細胞サブグループ×20種類の機能タンパク質の組み合わせにより、各グループで合計4480の特徴が得られます。

テストセット：以前にStelzerらによって収集された独立した質量分析フローサイトメトリーデータセット（Independent dataset）

このデータセットは本研究チームが以前に発表した縦断的な質量分析フローサイトメトリーデータセットであり、主にシミュレーション実験の臨床参照データセットとして使用されます。このデータセットには、自発的分娩前の最後の120日間において63名のボランティアから採血されたサンプルが含まれており、各人から1～3回採血しています。シミュレーション実験では、未刺激の正期産（58名の患者由来の153サンプル）および早産（5名の患者由来の14サンプル）のサンプルのみを使用しました。下図に示す通りです。

CellOT+Stablによる単一細胞レベルのデジタルツインシステム構築と治療効果のシミュレーション

SIMCOの中核的な設計目標は、単に妊婦が早産するかどうかを予測することではなく、特定の患者に個別化された薬物介入を施し、最終的に臨床ニーズに応じた早産予防を達成することです。言い換えれば、薬物が最終的な臨床転帰を変えられるか、また各患者に対して有効な結果をもたらすかを確認することです。これに基づき、研究チームはSIMCOに対して独創的な設計アプローチを提案しました。すなわち、単一細胞免疫応答のシミュレーションと臨床転帰モデリングを組み合わせることで、上記のニーズを満たすというものです。具体的には、下図に示すように3つのステップに分けられます。

第一ステップ、SIMCOはCellOTを用いた最適輸送（OT）学習を、高次元単一細胞撹乱データセット上で訓練し、単一細胞分解能で薬物撹乱後の免疫応答をエンコードします。 CellOTは入力凸ニューラルネットワーク（Input convex neural network）に基づくOT学習を実装しており、ネットワークは4層の全結合隠れ層を含み、その優位性はヘテロジェニアスな単一細胞撹乱応答を高精度で予測できる点にあります。本研究では、研究者たちはネットワーク構造を微調整し、4層のボトルネック構造（128、128、64、32）を追加し、潜在空間次元を50から42に削減して過学習を防ぎ、訓練期間は50000エポックに設定しました。

第二ステップ、SIMCOは学習された単一細胞撹乱の法則を、別の独立した免疫オミクスデータセットへ転移させます。 このデータセットにはベースラインサンプル（未刺激または未処理）とその関連する臨床転帰のみが含まれています。その後、これらのベースラインサンプルに基づき、SIMCOは単一細胞が撹乱（例：体外刺激や薬物治療）に直面した後の免疫応答をシミュレートし、各患者ごとに候補薬物を受けた場合／受けなかった場合の免疫オミクス対照デジタルツインペアを生成します。

第三ステップ、SIMCOはスパース機械学習アルゴリズムStablを用いて、患者訓練セットとシミュレーション免疫データに基づき、臨床転帰の多変量予測モデルを構築します。 保持された患者テストセットにおいて、SIMCOは各患者の治療を受けた場合と受けていない場合の2つのデジタルツインの予測結果を比較します。この差により薬物が臨床転帰に与える影響を定量化でき、SIMCOは候補薬物の免疫調節可能性をモデル化し、個別化治療計画の立案を支援することが可能になります。

具体的な計算リソースの設定において、CellOT は公式 Python パッケージ CellOT バージョン 0.1 を用いて実行され、スタンフォード大学のクラウドプラットフォーム Sherlock 上で学習・デプロイされました。最大メモリ要求量は 32 GB、各タスクの最大実行時間は 20 時間、各タスクで使用する GPU の最大数は 16 です。Stabl は Python パッケージ Stabl バージョン 1w を用いて実行され、時間変動の補正やデータセットの正則化などを含む基本的なデータ解析には、Python パッケージ Scipy 1.10.4、scikit-learn 1.5.2、pandas 2.2.3、numpy 1.26.4 に依存しています。可視化には seaborn 0.13.2 および matplotlib 3.10.3 が使用されました。

細胞レベルのデジタルツインが将来の早産個別化予防の基盤を築く

本研究ではまず、SIMCO 単一細胞摂動予測モデルの能力を検証しました。 SIMCO は細胞タイプごとに個別に訓練されました。DMSO 対照（未刺激サンプル）に基づいて細胞の刺激応答を学習し、各刺激条件下でも同様に DMSO 対照に基づいて薬物処理による応答を学習しました。データセット間の転移シミュレーションでは、モデルは摂動データセットと独立データセットに共通する 13 個の機能マーカーのみを用いて訓練されました。評価には平均絶対誤差（MAE）、決定係数（R²）、最大平均二乗偏差（MMD）という 3 つの指標を含む 4 重交差検証戦略が採用されました。

結果（下の図参照）は、SIMCO がすべての指標においてすべての訓練ベースラインを上回ることを示し、患者のヘテロジェネシティ（不均一性）を正確に捉え、正確な個別化摂動モデリングを実現できることを示しています。IL-2/4/6 刺激下で応答が強い（arcsinh 差値 > 0.1）マーカーと比較すると、シミュレーション値と実測値の分布が一致しており、SIMCO モデルが単一細胞レベルでの細胞ヘテロジェネシティを正確に特徴付けられることが証明されました。さらに注目すべきは、シミュレーション誤差と患者間のシグナル応答の差異自体との間に高い相関があること（スピアマン係数 R=0.93）です。個体差が最も大きいシグナル応答に対しても、SIMCO は個体間の相対的な差異を保持し、個体差を平均化することなく維持できます。

続いて、SIMCO が治療による分娩時期への影響を予測できることを検証しました。 本研究ではまず、治療を受けていない単一細胞デジタルツインデータに基づいて疎な多変量モデルを構築し、分娩までの時間を正確に予測しました（ピアソン相関係数 R=0.64、平均二乗誤差平方根（RMSE）=24.1 日、うち正期産群は 24 日、早産群は 25.4 日）。さらに、分娩時期の予測とサンプリング時点の情報を組み合わせ、期待される妊娠期間を推定した結果、SIMCO は正期産と早産のデジタルツインモデルを正確に区別できました（AUROC=0.75（95% CI 0.59-0.88）、AUPRC=0.29（0.12-0.54））。下の図に示します。

注目すべきは、CellOT シミュレーション特徴量を追加した場合、未刺激データのみの実測特徴量を使用した場合と比較して、SIMCO の予測性能が大幅に向上した点です。ピアソン相関係数は 0.34 から 0.61 へ、AUROC は 0.69 から 0.75 へ、AUPRC は 0.24 から 0.34 へ向上しました。独立データセットの完全な実測特徴量に基づいて構築された多変量モデルと比較しても、CellOT シミュレーション特徴量の追加により、ピアソン相関係数が 0.79 から 0.82 へ向上するなど、安定した小幅な性能向上が実現されました。

続いて研究者らは、SIMCO を用いて候補薬物による治療を受けたデジタルツインと未治療のデジタルツインにおける予測分娩時期の差異をシミュレーションしました。 Maprotiline、THF、SALPZ は全体的に予測分娩時期を遅らせる効果を示しました。一方、他の候補薬物は妊娠期間のウィンドウに応じて二相性の効果を示しました。

患者への治療の累積効果について、妊娠期間の長さで比較すると、SIMCO のシミュレーション結果で効果が最も強かった 3 つの薬物は、THF（平均 24.7 日、四分位範囲（IQR）= 11.4-45.9）、Maprotiline（平均 18.8 日、IQR= 8.6-27.5）、SALPZ（平均 17.3 日、IQR= 11.4-33.8）でした。もちろん、すべての患者が実際の臨床で特定の治療から利益を得られるわけではありません。そこで研究者らは、これら 3 つの薬物に対する患者間のヘテロジェネシティを定量化しました。THF、SALPZ、Maprotiline の各プロトコルで利益を得る患者の割合はそれぞれ 90.5%、87.3%、82.5% でした。一方、SA を単独で使用した場合、妊娠週数の延長が実現できたのは患者の 46% のみでした。

さらに、本研究は実験におけるブラックボックスのメカニズムを解明し、刺激と薬剤に関するメカニズム的な知見を提供した。 分娩時期の予測に重要な特徴は計21個あり、上位10個の特徴のうち5個はCD4⁺T細胞のシグナル伝達経路の応答を表している。特に注目すべき点として、GM-CSF、TNF-α、PI、IFN-αへの応答において、pSTAT3レベルの低下は妊娠初期の時点と相関しており、すなわち分娩が近づくにつれてSTAT3の活性化が増強する一方、顆粒球におけるpS6のベースライン値およびTNF-αにより誘導されるpS6レベルは妊娠後期、分娩間際に低下する。これに対し、THFおよびSALPZは、初期CD4⁺T細胞におけるpSTAT3シグナル伝達の持続的な抑制と、顆粒球におけるpS6応答の増強を通じて、妊娠進行に伴う免疫学的特徴を打ち消す効果を示した。全体として、THFおよびSALPZは上位10個の特徴のうち7個に対して有益な影響を与えた。

しかし同時に、本研究では、一部の薬剤が免疫マーカーを妊娠後期、分娩間際の特徴の方向へ変化させることも発見された。 例えば、THFおよびSALPZはPI刺激後に非マクロファージ細胞（ncMCs）におけるpMK2の活性化を強く抑制し、GM-CSF刺激後に中間型単球（intMCs）におけるpCREBの活性化を抑制するが、これらの特徴は本来、分娩間際により早期に活性化されるべきものである。一方、SIMCOは治療用デジタルツインの結果を予測する際、単一の「不利なシグナル」のみで薬剤が早産を促進すると判断するのではなく、すべての細胞、刺激条件、シグナル伝達経路にわたる多重な免疫調節効果を内在的に統合し、正味効果を算出することで、薬剤が最終的に妊娠期間を延長させるのか短縮させるのかを体系的に定量的に評価する。

まとめ

総じて、早産という世界的な生殖医療上の課題に対し、SIMCO単一細胞デジタルツインシステムは新たなアプローチを開いた。従来、妊娠中の新薬介入に関する臨床試験は倫理的・コスト的な制約により、候補案の前臨床検証を大規模に実施することが困難であった。SIMCOは、体外実験と計算による仮想スクリーニングを組み合わせた新たなアプローチを提供し、ヒトでの臨床試験へ移行する前に候補薬剤の潜在能力を優先的に評価することを可能にする。この単一細胞ツールは、薬剤が母体の免疫状態や分娩時期をどのように制御するかを予測することができ、将来的には個別化された早産予防策の設計にも貢献することが期待される。

本研究では同時に、SALPZ併用療法はアスピリンやランソプラゾール単剤とは異なる独自の免疫調節的特徴を備えており、その薬効は単純な足し算ではなく、薬剤間の相互作用が存在することを示唆している。SIMCOフレームワーク自体、およびシミュレーションで潜在能力を示したTHFやSALPZなどの候補案は、今後の早産予防に関するメカニズム研究および臨床試験において、探索すべき価値のある方向性を示している。