ナノスケールでの単一粒子追跡、厦門大学 Fang Ning チームが AI を使用して「細胞内のロック」を再生

ミクロの世界では、すべての細胞が賑やかな都市であり、分子はこの都市の住人です。これらの住民のあらゆる動きを追跡できれば、生命の謎の一角を解明できるかもしれないと想像してみてください。これは、生きた細胞内で 3D 単一粒子追跡 (SPT) を実行するという科学者の野心的な目標です。この技術を通じて、人々は細胞内の分子のあらゆる動作を観察し、それらがどのように相互作用して複雑な生命体を構築するかを理解することができます。

しかし、ミクロの世界で正確に追跡することは容易ではありません。銃撃戦の映画で高速で移動する弾丸を追跡することを想像してみてください。高速で移動する弾丸を追跡することは十分に困難ですが、分子は弾丸よりもはるかに速く移動することができ、その軌道は想像を絶するほど複雑です。科学者にとっての課題は、雪片の雲の中のそれぞれの雪片の軌跡を追跡するのと同じくらい難しいです。

細胞の三次元空間における分子の動きをリアルタイムで正確に追跡するために、アモイ大学の方寧教授のチームは、深層学習に基づいた自動高速多次元単一粒子追跡システムを開発しました。細胞微小環境におけるナノ粒子の回転追跡の限界を打ち破り、生きた細胞内の単一分子/単一ナノ粒子をナノスケールで全方位かつ正確に追跡することができます。三次元空間での変位を追跡するだけでなく、それを観察することもできます。初めての分子/ナノ粒子の回転運動。現在、この論文は権威ある雑誌「Nano Letters」に掲載されている。

研究のハイライト:

• 深層学習アルゴリズムと統合された単一粒子追跡システムは、信号対雑音比 (S/N) が低い条件下での回転追跡の限界を克服するために構築されました。 

• このシステムを使用すると、生細胞内の異方性金ナノ粒子プローブの三次元配向を高い位置精度 (<10 nm) と時空間分解能 (0.9 ミリ秒) で追跡できます。
• このシステムは従来の方法よりも堅牢でノイズ耐性があり、生細胞内の微小管に沿って輸送される貨物の動きを研究することで効果的であることが証明されています。

用紙のアドレス:
https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c04870
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SPT システム: 自動、高速、多次元単一粒子追跡システム

生きた細胞の動的なプロセスをより完全に理解するために、研究ではまず多次元イメージング デバイスを開発しました。

上の図に示すように、イメージング デバイスには、二焦点面イメージング、視差顕微鏡、および自動追跡機能が統合されています。

二焦点面イメージング

集光レンズを通過した光束は、対物レンズ(OBJ)、対物レンズスキャナー(OS)を通過し、集光光路中に反射透過率7:3のビームスプリッター(BS)を挿入します。 、収集された信号は 2 つのイメージング チャネル (フォーカス チャネルとデフォーカス チャネル) に分割され、それによって二重焦点面イメージングが実現されます。 750 mm の凸レンズ (上図の L1) をデフォーカス チャネルに挿入して、フォーカス チャネルとデフォーカス チャネルの間に約 900 nm の軸方向の分離を確立し、それによって最適なデフォーカス パターンを生成します。

視差顕微鏡

取得された信号は、ウェッジ プリズム (WP) によって 2 つの鏡像で垂直に配置された画像に分割されます。この装置は、Δy とΔz の間の正確な関係を確立し、異なる z 軸位置でのプローブの 2 つの画像間の距離を記録することによって校正曲線を構築します。次に、プローブの 2 つの鏡像点間の xy 平面上の距離を計算することにより、プローブの z 軸位置が決定されます。

自動追尾機能

このデバイスには、圧電対物スキャナー (p-725.4CD) とコントローラー (E-709) で構成される自動フィードバック追跡システムが統合されています。プローブの Z 軸の移動により 2 つのミラー点間の距離が変化すると、自動追跡プログラムは、その変化に基づいてターゲット スキャナが移動する必要がある距離を計算します。

モデルアーキテクチャ: 入力層 + 4 つの畳み込みブロック + 3 つの全結合層

データ分布の多様性を確保するために、この研究では、画像のスケーリング、異なるレベルのガウス ノイズの追加、および位置変換の実行により、トレーニングと検証用に同じ割合のシミュレーション データと実験データを混合しました。

Visual Geometry Group (VGG) モデルに触発されたこの研究では、入力画像を 3 次元方向 (方位角 φ と極角 θ) にマッピングすることにより畳み込みニューラル ネットワーク モデルを構築しました。

一般に、畳み込みブロックの数は、背景のある多層画像の特徴抽出にとって重要です。したがって、この研究では、1 ～ 4 個の畳み込みブロックをそれぞれ使用して CNN アーキテクチャをテストしました。研究結果は、4 つの畳み込みブロックを含む CNN モデルの誤差が最も小さいことを示しています。

結果から、この研究の CNN モデルは、最終的には入力層、4 つの畳み込みブロック、および 3 つの全結合 (FC) 層で構成されます。で：

• 入力層は固定サイズの画像を受け入れ、それらをテンソルに変換して渡すことができます。

• 4 つの畳み込みブロックには、複数の畳み込み層とプーリング層が含まれています。  

  a. 4 つの畳み込みブロックには、それぞれ 64、128、256、および 512 個の畳み込みカーネルが含まれています。すべての畳み込み層はバッチ正規化を通過し、整流線形単位 (ReLU) アクティベーション関数によってモデルが確実に一致します。より速く収束し、過剰適合を防ぐと同時に、ニューラル ネットワークの非線形マッピング機能も強化します。

    b. プーリング層は、変換の不変性を確保しながら、ネットワークの計算パラメータを削減します。

• それぞれ 2048、2048、451 個のニューロンを含む 3 つの完全に接続された層は、畳み込み層とプーリング層によって抽出された特徴をより高いレベルの式に統合でき、ネットワークがより複雑な決定と分類を行うことができます。

CNN-exp、CNN-sim、CNN-sim+exp の 3 つのモデルの損失曲線を調べることにより、シミュレーションされたデータ セットについて次のことが結果からわかります。CNN モデルは 30 エポック後に収束に達します。比較すると、実験データセットを使用したトレーニングでは、収束するまでに約 90 エポックが必要です。さらに、CNN-sim+exp モデルは比較的早く収束します。

耐騒音性能評価と荷動き研究、CNNモデルはさらなる利点を備えています

実際のアプリケーションでは、高い時空間分解能と細胞生存率が生細胞イメージングに影響します。したがって、この研究では、4、2、1.4 のさまざまな信号対雑音比条件下で CNN モデルのノイズ耐性とロバスト性をテストし、従来の CC (相関係数) 法と比較しました。

研究結果によると、信号対雑音比が 4 の場合、CNN と CC の両方の手法は良好なパフォーマンスと小さな誤差を示し、信号対雑音比が 2 に低下すると誤差は両方とも 2° 未満になります。 CNN 法の誤差増加は CC 法の 5 分の 1 にすぎません。信号対雑音比が 1.4 の場合、CC 法は粒子の方向を区別できませんが、CNN モデルの誤差は依然として許容範囲内にあります。許容範囲。

これは、信号対雑音比が低い環境では、CNN モデルが CC 手法よりも耐ノイズ性が高く、堅牢であることを示しています。

ATP 加水分解によって生成されるエネルギーは、細胞内分子を駆動して貨物を輸送する「モーター」です。したがって、カーゴの特徴的な並進運動と回転運動は、カーゴとキネシンの結合状態に関する豊富な情報を提供し、カーゴとモーターと微小管の相互作用を解明するための新たな視点を提供する可能性があります。簡単に言えば、この研究は、自動高速多次元SPTイメージング装置と深層学習モデル（CNN-sim+expモデル）を組み合わせて、生きた細胞の微小管骨格に沿ってキネシンがカーゴを輸送する動的プロセスを研究しました。

輸送プロセス全体で、商品は 2 つの停止段階といくつかのアクティブな輸送段階を経ました。

最初の一時停止段階では、貨物はほとんど回転の自由がありません。これは、貨物が緊密な取り付けモードにあることを示しています。 2 つの一時停止フェーズの間に、商品はアクティブな輸送フェーズにあり、自動追跡システムは約 300nm の軸方向の変位を記録しました。これは、従来のイメージング方法では取得することが困難です。

2 番目の一時停止フェーズでは、貨物の移動状態は、密着状態と固定回転状態の間で継続的に切り替わります。密着モードでは、積荷はさまざまなキネシンを介して微小管にしっかりと接続されており、自由に回転することはほとんどありません。係留回転モードでは、積荷は微小管に緩く結合しており、常に新しい微小管を探して接続しています。一般的に、この一連の動きは、細胞内輸送のダイナミクスと複雑さ、そして微小管トラックに沿った貨物の移動を促進する際のキネシンの役割を浮き彫りにします。

13年間のアメリカ勤務を経て母校へ帰国

研究者らの徹底した調査に基づいて、この論文の責任著者である厦門大学の方寧教授の存在が私たちの目に入りました。学習経験という観点から見ると、方寧教授は、「途中で才能を伸ばし、母校に恩返しをする」という模範と言えるでしょう。

Fang Ning 教授は、1998 年にアモイ大学化学科を卒業した後、カナダのブリティッシュ コロンビア大学および米国エネルギー省のエイムズ国立研究所で博士課程および博士研究員の研究を行い、そこで David 教授の指導を受けました。 DYChen 氏と国際的に有名な分析化学教授 Edward S. Yeung 氏。

Fang Ning 教授は、米国で 13 年間勤務した後、ジョージア州立大学の正教授に昇進しました。国内の光イメージング分野に貢献するため、方寧教授は2021年に中国に常勤で帰国する予定です。厦門大学の化学・化学工学部に特別教授として入学し、化学および生体光学イメージング技術を開発し、これらの先駆的なツールを利用してナノマテリアル、触媒の分野で単一分子および単一粒子レベルの研究を実施これまでに、Nature Catalysis、Nature Cell Biology、Chemical Reviews、Nature Communications、Science Advances、JACS、Angewandte Chemie などの雑誌に 90 以上の論文を発表しています。

現在、方寧教授は、アモイ大学に単分子、単粒子、および光学顕微鏡イメージング研究室を独自に設立し、分子とナノ材料の光学イメージングの分野に焦点を当て、単粒子回転追跡技術、ラマン分光法を開発しました。 + 高度なイメージング、レーザー スライススキャンイメージング、超解像光学イメージング、全反射蛍光、全反射暗視野を含む 6 つの主要な研究方向が国内にあります。単一分子、単一粒子、光学顕微鏡イメージングの分野で優れた業績。

早ければ2021年にも、Fang Ning 教授のチームは、新しい単一粒子回転追跡システムと 3 次元角度単一粒子追跡技術を開発しました。受容体媒介エンドサイトーシスの機構を解明し、細胞内の小胞輸送の回転ダイナミクスをリアルタイムで解明することにおいて、画期的な進歩が見られました。 AI の押し寄せる波に直面して、研究チームは光学イメージング分野における AI 技術の卓越した価値を痛感しています。この研究は、生きた細胞の生命プロセスを研究するためにディープラーニング/AI 支援イメージングを使用するための第一歩です。

Fang Ning 教授のチームは次のように考えています。AI を実験に導入するには、画像の自動認識、運動パターンと細胞の挙動の分類と予測という 3 つの主要な分野でのブレークスルーが必要です。本研究成果は、計算機シミュレーションにより生成されたデータに基づく画像自動認識の第一段階の成果です。現在、研究チームは細胞生物学的プロセスの第 2 段階を特定し、決定しています。

3 つの主要な段階が完了すると、研究者は薬物送達のプロセスと結果を予測できるようになり、それが国内の製薬業界をリードすることになることは間違いありません。

参考文献:
1.https://mp.weixin.qq.com/s/mcO_7Mg40OmyauhbeB91QA
2.https://mp.weixin.qq.com/s/NnHGnBZRRbDOI_2sZu7irA
3.https://mp.weixin.qq.com/s/CUWhLnA-HuvxdZDzMfDxAA