Einzelpartikelverfolgung Im Nanomaßstab: Fang Nings Team an Der Xiamen-Universität Nutzt KI, Um „Rock in the Cell“ Zu Spielen

In der mikroskopischen Welt ist jede Zelle eine geschäftige Stadt und Moleküle sind die Bewohner dieser Stadt. Stellen Sie sich vor, wir könnten jede Bewegung dieser Bewohner verfolgen. Vielleicht könnten wir eine neue Ebene des Mysteriums des Lebens enthüllen. Dies ist das ehrgeizige Ziel von Wissenschaftlern, die 3D-Einzelpartikelverfolgung (SPT) in lebenden Zellen durchführen. Mithilfe dieser Technologie können Menschen jede Bewegung von Molekülen in Zellen beobachten und verstehen, wie sie miteinander interagieren und so komplexe lebende Organismen bilden.

Eine präzise Verfolgung in der mikroskopischen Welt ist jedoch nicht einfach. Stellen Sie sich vor, in einem Schießereifilm ist es schon schwierig genug, einer schnellen Kugel zu folgen, doch Moleküle bewegen sich viel schneller als Kugeln, und die Komplexität ihrer Bewegungsbahnen übersteigt jede Vorstellungskraft.Die Herausforderung für die Wissenschaftler ist ebenso schwierig wie der Versuch, die Flugbahn jeder einzelnen Schneeflocke in einem Himmel voller Schneeflocken zu verfolgen.

Um die Bewegung von Molekülen im dreidimensionalen Raum von Zellen in Echtzeit und genau zu verfolgen,Das Team von Professor Fang Ning an der Universität Xiamen hat ein automatisiertes, schnelles, mehrdimensionales Einzelpartikel-Trackingsystem auf Basis von Deep Learning entwickelt.Es durchbricht die Beschränkungen der Rotationsverfolgung von Nanopartikeln in der zellulären Mikroumgebung und ermöglicht eine umfassende und präzise Verfolgung einzelner Moleküle/einzelner Nanopartikel in lebenden Zellen im Nanomaßstab. Es verfolgt nicht nur ihre Verschiebung im dreidimensionalen Raum, sondern beobachtet erstmals auch die Rotationsbewegung von Molekülen/Nanopartikeln. Derzeit wurde der Artikel in der renommierten Fachzeitschrift Nano Letters veröffentlicht.

Forschungshighlights:

• Um die Einschränkungen der Rotationsverfolgung unter Bedingungen mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) zu überwinden, wurde ein einzelnes Partikelverfolgungssystem mit integriertem Deep-Learning-Algorithmus entwickelt. 

• Das System kann verwendet werden, um die 3D-Ausrichtung anisotroper Goldnanopartikelsonden in lebenden Zellen mit hoher Lokalisierungsgenauigkeit (<10 nm) und räumlich-zeitlicher Auflösung (0,9 ms) zu verfolgen.
• Das System ist robuster und störresistenter als herkömmliche Methoden und seine Wirksamkeit wurde durch die Untersuchung der Bewegung von Fracht entlang von Mikrotubuli in lebenden Zellen nachgewiesen.

Papieradresse:
https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c04870
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SPT-System: automatisches, schnelles, mehrdimensionales Einzelpartikel-Trackingsystem

Um ein umfassenderes Verständnis der dynamischen Prozesse in lebenden Zellen zu erlangen, wurde im Rahmen der Studie zunächst ein multidimensionales Bildgebungsgerät entwickelt:

Wie in der Abbildung oben gezeigt, integriert das Bildgebungsgerät bifokale Ebenenbildgebung, Parallaxenmikroskopie und Autotracking-Funktionen.

Duale Fokalebenen-Bildgebung

Nachdem der Lichtstrahl den Kondensor passiert hat, passiert er die Objektivlinse (OBJ) und den Objektivscanner (OS). Durch Einfügen eines Strahlteilers (BS) mit einem Reflexions-Transmissions-Verhältnis von 7:3 in den Sammellichtpfad kann das gesammelte Signal in zwei Abbildungskanäle (Fokuskanal und Defokuskanal) aufgeteilt werden, wodurch eine Abbildung mit zwei Brennebenen realisiert wird. Durch Einfügen einer 750-mm-Konvexlinse (L1 in der Abbildung oben) in den Defokussierungskanal wird ein axialer Abstand von etwa 900 nm zwischen dem Fokussierungskanal und dem Defokussierungskanal erzeugt, wodurch das am besten geeignete Defokussierungsmuster erzeugt wird.

Parallaxenmikroskop

Das erfasste Signal wird durch ein Keilprisma (WP) in zwei gespiegelte und vertikal ausgerichtete Bilder aufgeteilt. Das Gerät stellt die genaue Beziehung zwischen Δy und Δz her und erstellt eine Kalibrierungskurve, indem es den Abstand zwischen zwei Bildern der Sonde an verschiedenen Positionen der Z-Achse aufzeichnet. Die Z-Achsenposition der Sonde wird dann durch Berechnung des Abstands zwischen den beiden Spiegelpunkten der Sonde in der xy-Ebene bestimmt.

Automatische Tracking-Funktion

Das Gerät integriert ein automatisches Feedback-Tracking-System, das aus einem piezoelektrischen Objektivscanner (p-725.4CD) und einem Controller (E-709) besteht. Wenn die Bewegung der Sonde auf der Z-Achse dazu führt, dass sich der Abstand zwischen den beiden Spiegelpunkten ändert, berechnet das automatische Tracking-Programm anhand des Änderungswerts die Distanz, um die sich der Zielscanner bewegen muss.

Modellarchitektur: Eingabeschicht + 4 Faltungsblöcke + 3 vollständig verbundene Schichten

Um die Vielfalt der Datenverteilung sicherzustellen, wurden in dieser Studie simulierte und experimentelle Daten zu gleichen Teilen für Training und Verifizierung gemischt, indem Bilder skaliert, unterschiedliche Grade von Gaußschem Rauschen hinzugefügt und Positionstransformationen durchgeführt wurden.

Inspiriert durch das Modell der Visual Geometry Group (VGG) wurde in dieser Studie ein Convolutional-Neural-Network-Modell erstellt, indem das Eingabebild auf dreidimensionale Richtungen (Azimutwinkel φ und Polarwinkel θ) abgebildet wurde.

Generell ist die Anzahl der Faltungsblöcke für die Merkmalsextraktion mehrschichtiger Bilder mit Hintergrund entscheidend. Daher wurden in dieser Studie CNN-Architekturen mit 1–4 Faltungsblöcken getestet.Die Ergebnisse zeigen, dass das CNN-Modell mit 4 Faltungsblöcken den kleinsten Fehler aufweist.

Aus den ErgebnissenDas CNN-Modell dieser Studie besteht letztendlich aus einer Eingabeschicht, 4 Faltungsblöcken und 3 vollständig verbundenen (FC) Schichten.In:

• Die Eingabeebene akzeptiert ein Bild mit fester Größe und wandelt es zur Weitergabe in einen Tensor um.

• Die 4 Faltungsblöcke enthalten mehrere Faltungsschichten und Pooling-Schichten:  

  A. Die vier Faltungsblöcke enthalten jeweils 64, 128, 256 und 512 Faltungskerne. Die Größe aller Faltungskerne beträgt 3×3. Jede Faltungsschicht durchläuft eine Batch-Normalisierung und eine Aktivierungsfunktion der Rectified Linear Unit (ReLU), um sicherzustellen, dass das Modell schneller konvergieren kann und eine Überanpassung verhindert wird. Gleichzeitig wird die nichtlineare Abbildungsfähigkeit des neuronalen Netzwerks verbessert.

    B. Die Pooling-Schicht reduziert die Rechenparameter des Netzwerks und gewährleistet gleichzeitig die Übersetzungsinvarianz.

• Die drei vollständig verbundenen Schichten, die jeweils 2048, 2048 und 451 Neuronen enthalten, können die von den Faltungs- und Pooling-Schichten extrahierten Merkmale in Ausdrücke auf höherer Ebene integrieren, wodurch das Netzwerk komplexere Entscheidungen und Klassifizierungen treffen kann.

Durch die Untersuchung der Verlustkurven der drei Modelle CNN-exp, CNN-sim und CNN-sim+exp zeigen die Ergebnisse, dass für den simulierten DatensatzDas CNN-Modell kann nach 30 Epochen Konvergenz erreichen.Im Gegensatz dazu erfordert das Training mit dem experimentellen Datensatz etwa 90 Epochen bis zur Konvergenz. Darüber hinaus ist die Konvergenzgeschwindigkeit des CNN-sim+exp-Modells relativ schnell.

Lärmschutzbewertung und Frachtbewegungsforschung: CNN-Modell bietet mehr Vorteile

In praktischen Anwendungen wirken sich eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung und Zelllebensfähigkeit auf die Bildgebung lebender Zellen aus. Daher testete diese Studie die Rauschresistenz und Robustheit des CNN-Modells unter verschiedenen Signal-Rausch-Verhältnisbedingungen wie 4, 2 und 1,4 und verglich es mit der herkömmlichen CC-Methode (Korrelationskoeffizient).

Die Forschungsergebnisse zeigen, dass bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 4 sowohl die CNN- als auch die CC-Methode eine gute Leistung und geringe Fehler aufweisen, wobei die Fehler weniger als 2° betragen; Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis auf 2 sinkt, beträgt der Fehleranstieg der CNN-Methode nur ein Fünftel des Fehleranstiegs der CC-Methode. Bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 1,4 kann die CC-Methode die Richtung der Partikel nicht unterscheiden, während der Fehler des CNN-Modells noch in einem akzeptablen Bereich liegt.

Dies zeigt, dass das CNN-Modell in einer Umgebung mit geringem SNR rauschresistenter und robuster ist als die CC-Methode.

Die durch die Hydrolyse von ATP erzeugte Energie ist der „Motor“, der Moleküle innerhalb der Zelle antreibt, um Fracht zu transportieren. Daher können die charakteristischen Translations- und Rotationsbewegungen der Fracht eine Fülle von Informationen über den Bindungsstatus der Fracht an Kinesin liefern und eine neue Perspektive für die Aufklärung der Wechselwirkungen zwischen Fracht, Motor und Mikrotubuli eröffnen. Einfach ausgedrückt wurde in dieser Studie ein automatisches Hochgeschwindigkeits-SPT-Bildgebungsgerät mit mehreren Dimensionen in Kombination mit einem Deep-Learning-Modell (CNN-Sim+Exp-Modell) verwendet, um den dynamischen Prozess des Transports von Motorproteinen entlang des Mikrotubuli-Skeletts in lebenden Zellen zu untersuchen.

Während des gesamten Transportvorgangs durchlief die Fracht zwei Pausenphasen und mehrere aktive Transportphasen.

Während der ersten Pause hat die Ladung nur wenig Rotationsfreiheit, was darauf schließen lässt, dass sie fest angebunden ist. Zwischen den beiden Pausenphasen befindet sich die Fracht in einer aktiven Transportphase.Das automatische Trackingsystem registrierte eine axiale Verschiebung von etwa 300 nm.Dies ist mit herkömmlichen Bildgebungsverfahren nur schwer zu erreichen.

In der zweiten Pausenphase wird der Bewegungszustand der Ladung ständig zwischen fester Verankerung und angebundener Rotation gewechselt. Im engen Anheftungsmodus kann die Fracht durch eine Vielzahl von Motorproteinen fest an Mikrotubuli angeheftet werden und dreht sich selten frei. Im angebundenen Rotationsmodus ist die Fracht lose an die Mikrotubuli gebunden und sucht ständig nach neuen Mikrotubuli und verbindet sich mit ihnen. Im Allgemeinen,Diese Bewegungsreihe verdeutlicht die Dynamik und Komplexität des intrazellulären Transports und die Rolle der Kinesine bei der Erleichterung der Bewegung von Fracht entlang der Mikrotubuli-Bahnen.

Nachdem er 13 Jahre in den Vereinigten Staaten gearbeitet hatte, kehrte er an seine Alma Mater zurück

Aufgrund eingehender Recherchen der Forscher gelangten wir zu dem korrespondierenden Autor dieses Artikels, Professor Fang Ning von der Universität Xiamen. Aus der Perspektive der StudienerfahrungProfessor Fang Ning ist ein Vorbild darin, „nach Erfolg zu streben und seiner Alma Mater etwas zurückzugeben“.

Im Jahr 1998, nach seinem Abschluss an der Fakultät für Chemie der Universität Xiamen, führte Professor Fang Ning seine Doktor- und Postdoktorandenforschung an der University of British Columbia in Kanada und am Ames National Laboratory des US-Energieministeriums durch, jeweils unter der Aufsicht von Professor David DYChen und Professor Edward S. Yeung, einem international renommierten analytischen Chemiker.

Nach 13-jähriger Tätigkeit in den USA wurde Professor Fang Ning zum ordentlichen Professor an der Georgia State University befördert. Um Beiträge zum Bereich der optischen Bildgebung im Land zu leisten, kehrte Professor Fang Ning im Jahr 2021 in Vollzeit nach China zurück.Er wurde als angesehener Professor an die Fakultät für Chemie und Chemieingenieurwesen der Universität Xiamen berufen und entwickelte dort chemische und biooptische Bildgebungstechnologien. Mithilfe dieser bahnbrechenden Werkzeuge führte er Einzelmolekül- und Einzelpartikelforschung in den Bereichen Nanomaterialien, Katalyse und Biophysik durch. Bis heute hat er mehr als 90 Artikel in Zeitschriften wie Nature Catalysis, Nature Cell Biology, Chemical Reviews, Nature Communications, Science Advances, JACS und Angewandte Chemie veröffentlicht.

Derzeit hat Professor Fang Ning an der Universität Xiamen eigenständig ein Labor für Einzelmolekül-, Einzelpartikel- und optische Mikroskopie aufgebaut. Mit seinem Schwerpunkt auf dem Gebiet der optischen Bildgebung von Molekülen und Nanomaterialien hat er in China sechs wichtige Forschungsrichtungen entwickelt, darunter Einzelpartikel-Rotationsverfolgungstechnologie, Raman-Spektroskopie + fortschrittliche Bildgebung, Laser-Sheet-Scanning-Bildgebung, optische Bildgebung mit Superauflösung, Totalreflexionsfluoreszenz und Totalreflexions-Dunkelfeld. Er hat herausragende Leistungen auf den Gebieten der Einzelmolekül-, Einzelpartikel- und optischen Mikroskopie erbracht.

Bereits 2021Das Team von Professor Fang Ning hat ein neues Einzelpartikel-Rotationsverfolgungssystem und eine dreidimensionale Winkel-Einzelpartikelverfolgungstechnologie entwickelt.Bei der Aufklärung des Mechanismus der rezeptorvermittelten Endozytose und der Analyse der Rotationsdynamik des Vesikeltransports in Zellen in Echtzeit wurden bahnbrechende Fortschritte erzielt. Angesichts der rasant zunehmenden KI-Welle war sich das Team des herausragenden Werts der KI-Technologie im Bereich der optischen Bildgebung bewusst. Diese Studie ist der erste Schritt zur Nutzung von Deep Learning/KI-gestützter Bildgebung zur Untersuchung der Lebensprozesse lebender Zellen.

Das Team von Professor Fang Ning glaubt, dassDie Einführung von KI in Experimente erfordert Durchbrüche in drei Hauptbereichen: automatische Erkennung von Bildern, Klassifizierung und Vorhersage von Bewegungsmustern und Zellverhalten.Die Forschungsergebnisse stellen Zwischenergebnisse der ersten Phase der automatischen Bilderkennung auf Basis von Daten dar, die durch computergestützte Simulation generiert wurden. Das Team arbeitet derzeit an der Identifizierung und Charakterisierung der zellulären biologischen Prozesse, die während der zweiten Phase auftreten.

Es besteht kein Zweifel daran, dass Forscher nach Abschluss aller drei Phasen in der Lage sein werden, den Ablauf und die Ergebnisse der Arzneimittelverabreichung vorherzusagen, was auch der heimischen Pharmaindustrie als Vorbild dienen wird.

Quellen:
1.https://mp.weixin.qq.com/s/mcO_7Mg40OmyauhbeB91QA
2.https://mp.weixin.qq.com/s/NnHGnBZRRbDOI_2sZu7irA
3.https://mp.weixin.qq.com/s/CUWhLnA-HuvxdZDzMfDxAA