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Inhalte im Überblick:Seit dem 20. Jahrhundert ist die Technologie der Stammzellen- und regenerativen Medizin eine der heißesten Grenzen im internationalen biomedizinischen Bereich. Heute erforschen Forscher Möglichkeiten, Stammzellen in spezifische Zelltypen umzuwandeln. Während dieses Prozesses können Stammzellen jedoch unregelmäßig wachsen oder sich spontan in verschiedene Zelltypen differenzieren. Daher ist die Frage, wie sich Wachstum und Differenzierung von Stammzellen kontrollieren lassen, eine der Herausforderungen für die Forscher. In diesem Artikel versuchten Forscher, darunter die Forschungsgruppe von Zhao Yang an der Universität Peking, maschinelles Lernen auf den Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen anzuwenden, um die Situation wirksam zu verbessern und der regenerativen Medizin neue Richtungen zu geben.

Schlüsselwörter:Pluripotente Stammzellen Bildanalyse Maschinelles Lernen

Dieser Artikel wurde zuerst auf der öffentlichen HyperAI WeChat-Plattform veröffentlicht~

Pluripotente Stammzellen (PSCs) sind eine Art multipotenter Zellen, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Selbstreplikation besitzen. Sie können sich in vitro unbegrenzt vermehren und in verschiedene Zelltypen differenzieren.Der Ersatz beschädigter Zellen und die Förderung der Wiederherstellung beschädigter Gewebefunktionen haben neue Hoffnung für die Behandlung von Augenkrankheiten, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Erkrankungen des Nervensystems gebracht.

Der derzeitige gezielte Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen führt jedoch zu Problemen wie einer instabilen Differenzierung zwischen Zelllinien (Linie zu Linie) und Chargen (Charge zu Charge), wodurch die Herstellung funktionaler Zellen zeitaufwändig und mühsam wird und die Forschung und Entwicklung sowie die Massenproduktion von Produkten für die klinische Anwendung pluripotenter Stammzellen ernsthaft behindert wird.Daher ist es besonders wichtig, den Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen in Echtzeit zu überwachen.

Kürzlich haben die Forschungsgruppen von Zhao Yang und Zhang Yu von der Peking-Universität zusammen mit der Forschungsgruppe von Liu Yiyan von der Jiaotong-Universität Peking ein Differenzierungssystem entwickelt, das auf der dynamischen Hellfeldbildgebung lebender Zellen und maschinellem Lernen basiert. Das System kann den Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen in Echtzeit intelligent regulieren und optimieren und eine effiziente und stabile Produktion funktioneller Zellen erreichen.Die Forschungsergebnisse wurden kürzlich in der Fachzeitschrift Cell Discovery unter dem Titel „Eine auf Live-Cell-Bildern basierende maschinelle Lernstrategie zur Reduzierung der Variabilität in PSC-Differenzierungssystemen“ veröffentlicht.

Die Forschungsergebnisse wurden in der Fachzeitschrift Cell Discovery veröffentlicht.

Papieradresse:

https://www.nature.com/articles/s41421-023-00543-1

Experimentübersicht

Derzeit können mithilfe der Mikroskopietechnologie Bilder von Zellen aufgenommen und mithilfe von Methoden des maschinellen Lernens Zellbilder analysiert werden.Daher wurden in dieser Studie Algorithmen des maschinellen Lernens verwendet, um Zellen in Hellfeldbildern zu identifizieren und zu klassifizieren und so ihre Abstammung oder Zellzusammensetzung zu bestimmen. Dies hilft den Forschern, die Zellstruktur und -funktion besser zu verstehen.

Es wurde nachgewiesen, dass die Forschungsergebnisse den Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen in Kardiomyozyten (CM) sowie chimäre Leber- und Nierenzellen effektiv optimieren und verbessern können.Die gesamte Forschungsmethode und der gesamte Forschungsprozess sind wie folgt:

Abbildung 1: Durch maschinelles Lernen optimiertes PSC-zu-CM

A:Das obere Diagramm zeigt, dass in jedem PSC-Differenzierungsprozess Variabilität vorhanden ist, und das untere Diagramm zeigt, dass maschinelles Lernen, das auf die oben genannten Differenzierungsprozesse angewendet wird, die Variabilität effektiv reduziert.

B:Differenzierungsprozess von PSC zu CM unter Verwendung kleiner Molekülmodulatoren zur Regulierung des kanonischen Wnt-Signalwegs. Grüne Pfeile zeigen die Dauer und Konzentration der CHIR-Regulierung in der ersten Phase an und farbige Punkte zeigen Kontrollpunkte des maschinellen Lernens an.

C:Verzögerte Hellfeldbilder und cTnT-Fluoreszenzergebnisse über einen Zeitraum von 10 Tagen.

D:Die Lage und Morphologie der Zellen, die sich während des gesamten Prozesses erfolgreich differenziert haben bzw. nicht differenziert haben.

e:Die Textur und Morphologie erfolgreich differenzierter Zellen verändern sich vom 5. bis zum 12. Tag.

F:Variabilität der Differenzierungseffizienz von Zeile zu Zeile.

G:Differenzierungsvariabilität zwischen verschiedenen Zellchargen.

H:Änderungen in lokalen Merkmalen von Differenzierungsbildern bei unterschiedlichen CHIR-Dosen.

Experimentelle Verfahren

Experimenteller Datensatz

Am Beispiel der Differenzierung von PSC zu CM nutzten die Forscher die vollautomatische Bildgebungsplattform Zeiss Cell Discover 7 für lebende Zellen, um Hellfeldbilder des Differenzierungsprozesses in Echtzeit aufzunehmen und den gesamten Prozess zu verfolgen, wie in Abbildung 1b oben dargestellt. Am Ende der Differenzierung wurden erfolgreich differenzierte CMs durch Fluoreszenzmarkierung mit cTnT, einem kardiomyozytenspezifischen Marker, identifiziert.Um die Vielfalt der Bilder zu erhöhen, führten die Forscher während dieses Prozesses mehrere Variablen ein (verschiedene PSCs, anfängliche Zelldichte, Differenzierungsmedium, unterschiedliche CHIR-Dosen) und sammelten schließlich mehr als 7,2 Millionen Bilder.

Experimentelle Ergebnisse

Durch die Kombination von Live-Cell-Imaging-Technologie und maschinellem LernenDieses Experiment erzielte die folgenden vier Ergebnisse:

* Maschinelles Lernen kann den Zustand differenzierter Zellen genau identifizieren und die Differenzierungseffizienz abschätzen.

Die Forscher stellten fest, dass die Zellen, die sich schließlich in CMs differenzierten, nämlich CPCs (kardiale Vorläuferzellen), am sechsten Tag des Differenzierungsprozesses eine spindelförmige Gestalt annahmen.Daher verwendeten sie ein schwach überwachtes Modell zur Identifizierung solcher Zellen in Hellfeldbildern und nannten es „Image-Recognized CPC (IR-CPC)“.Wie in Abbildung 2 unten dargestellt, kamen die Forscher zu dem Schluss, dass die Korrelation zwischen dem Anteil von IR-CPC in den Gesamtzellen und der tatsächlichen Differenzierungseffizienz 88% betrug.

Abbildung 2: Zusammenhang zwischen IR-CPC-Verhältnis und tatsächlicher Differenzierungseffizienz

Gleichzeitig verwendeten die Forscher das Deep-Learning-Modell pix2pix, um die Hellfeldbilder der CM-Induktionsphase (d. h. der ersten Phase der Differenzierung) vorherzusagen.Wie in der folgenden Abbildung gezeigt, beträgt die Korrelation zwischen der vorhergesagten Differenzierungseffizienz und der tatsächlichen Differenzierungseffizienz 93%.

Abbildung 3: Zusammenhang zwischen prognostizierter und tatsächlicher Differenzierungseffizienz

Die obigen Experimente zeigen, dass maschinelles Lernen den Zellstatus in verschiedenen Differenzierungsstadien identifizieren und Echtzeitvorhersagen der Differenzierungsergebnisse treffen kann.

* Maschinelles Lernen kann die Differenzierungszeit und die Induktionsfaktorkonzentration in Echtzeit vorhersagen.

Während des Differenzierungsprozesses stellten die Forscher fest, dass im Mesodermstadium (0-3 Tage) die Dosis (Konzentration und Behandlungszeit) des Induktors CHIR99021 (CHIR) einen größeren Einfluss auf die Differenzierungseffizienz hatte.Sie erstellten ein logistisches Regressionsmodell basierend auf den CHIR-bezogenen Merkmalen in den Hellfeldbildern im frühen Stadium der Differenzierung (0–12 h), um die CHIR-Konzentration in den Vertiefungen (niedrig, mittel, hoch) vorherzusagen.Wie in der folgenden Abbildung gezeigt, erreicht die Genauigkeit des Modells bei der Beurteilung der Konzentration jeder Vertiefung (ein Laborgegenstand mit mehreren kleinen Löchern) 93,1%, wenn die CHIR-Behandlungszeit auf 24 Stunden festgelegt wird.

Abbildung 4: Modellvorhersage der CHIR-Konzentration in der Pore

Gleichzeitig verglichen die Forscher die Vorhersageergebnisse (d. h. Abweichungswerte) des Modells bei unterschiedlichen CHIR-Behandlungszeiten (24 h, 36 h oder 48 h), um die optimale CHIR-Behandlungszeit zu ermitteln. Wie in Abbildung 5 unten gezeigt,Die optimale CHIR-Behandlungszeit betrug ungefähr 12 Stunden (mit dem geringsten Abweichungswert). Darüber hinaus kann, wie in Abbildung 6 dargestellt, die CHIR-Konzentration angepasst werden, um die Differenzierungseffizienz entsprechend den Ergebnissen der Modellvorhersage zu verbessern.

Abbildung 5: Modell prognostiziert optimale CHIR-Verarbeitungszeit

Abbildung 6: Differenzierungsergebnisse mit und ohne CHIR-Konzentrationsanpassung

Die oben genannten Experimente zeigen, dass durch maschinelles Lernen ein Eingriff in die Dosierung von Induktoren möglich ist.

* Maschinelles Lernen kann den optimalen Zustand für die PSC-Initiierungsdifferenzierung in Echtzeit bestimmen.

Die Forscher stellten fest, dass sich die Zellen selbst bei moderaten CHIR-Konzentrationen nicht differenzierten, und vermuteten, dass dies auf eine räumlich variable Differenzierung zurückzuführen sei.Das heißt, dass Zellen am Rand der PSC-Kolonie am Tag 0 der Differenzierung eher erfolgreich sind, während Zellen im Zentrum der PSC-Kolonie eher scheitern.

Als Reaktion darauf entwickelten die Forscher ein auf Zufallswäldern basierendes maschinelles Lernmodell, um die Bildmerkmale von Ausgangszellen mit einer hohen Differenzierungserfolgsrate zu identifizieren. Die Modellergebnisse zeigten, dass Zellen mit mittlerer Zellfläche sowie längeren und holprigeren Rändern eher erfolgreich differenzieren, was mit tatsächlichen Beobachtungen übereinstimmt.. Basierend auf diesem Modell stellten die Forscher fest, dass die Korrelation zwischen der Vorhersage des anfänglichen PSC-Zustands und der tatsächlichen Differenzierungseffizienz 76% betrug, wie in Abbildung 7 unten dargestellt.

Darauf aufbauend griffen die Forscher auch künstlich ein und veränderten die ursprüngliche Morphologie der Zellen.Die Differenzierungseffizienz wurde effektiv von 21,6% ± 2,7% auf 88,8% ± 10,5% erhöht.

Abbildung 7: Zusammenhang zwischen der Identifizierung des Zellausgangszustands und der Vorhersage der Differenzierungseffizienz

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass maschinelles Lernen eine Qualitätskontrolle des Anfangszustands von PSC durchführen kann.

* Maschinelles Lernen kann beim Screening kleiner Molekülverbindungen helfen und die Differenzierungsstabilität verbessern.

Die Forscher stellten fest, dass die CHIR-Konzentration einer der wichtigsten Faktoren ist, die die Differenzierung beeinflussen. Daher versuchten sie, ein Screening kleiner Moleküle durchzuführen, um mit neuen Verbindungen ungeeignete CHIR-Konzentrationen auszugleichen. Wie in der Abbildung unten gezeigt,Basierend auf Hellfeldbildern lebender Zellen am 6. Tag des Differenzierungsprozesses und dem etablierten schwach überwachten Modell bauten die Forscher eine Screening-Plattform für kleine Moleküle und filterten erfolgreich die Verbindung BI-1347 aus mehr als 3.000 kleinen Molekülen heraus.

Abbildung 8: Maschinelles Lernen beim Screening kleiner Molekülverbindungen

Die obigen Experimente zeigen, dass Forscher auf der Grundlage des maschinellen Lernmodells eine Screening-Plattform für kleine Moleküle erstellen können, um den Screening-Experimentzyklus zu verkürzen und die Screening-Kosten zu senken.Darüber hinaus haben die mit dieser Technologie gescreenten kleinen Moleküle den CHIR-Dosierungsbereich erweitert und dadurch die Gesamtstabilität des PSC-Differenzierungsprozesses verbessert.

Um die Anwendungsszenarien zu erweitern, wandten die Forscher die Ergebnisse dieser Studie schließlich auf die frühen Stadien der Differenzierung von Nierenvorläuferzellen und Hepatozyten an und erzielten auch genaue Vorhersageergebnisse.Dieses Forschungsergebnis kann eine Echtzeit-Anleitung für den Differenzierungsprozess pluripotenter Stammzellen liefern.

Zelltherapie: ein neuer Weg für die Biomedizin

Die Zelltherapie ist eine neue Behandlungsmethode, die bei vielen Krankheiten (Krebs, genetische Erkrankungen) gute therapeutische Wirkungen gezeigt hat. Die wichtigsten Behandlungsmethoden sind in Immunzelltherapie und Stammzelltherapie unterteilt.Unter ihnen sind Stammzellen aufgrund ihrer Funktionen wie multidirektionale Differenzierung, Immunregulation und Zytokinsekretion zu einer der zentralen Forschungsrichtungen in diesem Bereich geworden.

Derzeit ist die Entwicklung der Zelltherapie in meinem Land relativ kurz, aber die Zukunftsaussichten sind sehr gut.Einerseits könnten die nächsten zehn Jahre den Daten zufolge eine Zeit schnellen Wachstums in diesem Bereich sein. Den einschlägigen Daten zufolge wird der Umfang des Zelltherapiemarktes in meinem Land voraussichtlich von 1,3 Milliarden Yuan im Jahr 2021 auf 58,4 Milliarden Yuan im Jahr 2030 wachsen, mit einer durchschnittlichen jährlichen Wachstumsrate von 53%. Andere Daten zeigen, dass der Markt für Zell- und Gentherapie in meinem Land im Jahr 2025 voraussichtlich 2,59 Milliarden US-Dollar erreichen wird, was einer durchschnittlichen Wachstumsrate von 276% entspricht.

Andererseits haben auch die lokalen Regierungen kontinuierlich entsprechende Maßnahmen eingeführt, um diesen Bereich zu unterstützen und zu fördern.Beispielsweise entwickeln Peking, Shanghai, Tianjin, Shenzhen und andere Orte die Zelltherapiebranche energisch. Shanghai hat den „Shanghai-Aktionsplan zur Förderung technologischer Innovation und industrieller Entwicklung der Zelltherapie (2022–2024)“ ins Leben gerufen, der vorsieht, bis 2024 eine Größenordnung von 10 Milliarden Yuan in Shanghais Zelltherapiebranche zu erreichen. Im vergangenen Jahr veröffentlichte Shenzhen eine Reihe von Dokumenten zur Unterstützung der Entwicklung der biopharmazeutischen Industrie, wobei der Schwerpunkt auf der Unterstützung der qualitativ hochwertigen Entwicklung von Industrieclustern liegt, die auch Zelltherapiemedikamente umfassen.

Datensatz und Codeadresse:

https://GitHub.com/zhaoyanglab/ML-for-psc-differentiation

Referenzlinks:

[1]https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_23417694

[2]http://www.cls.edu.cn/Research/Research_Achievements6067.shtml

[3]https://stcsm.sh.gov.cn/zwgk/ghjh/20221104/f7b02ab5db40439e8d93f15b9dd206da.html

[4]http://legacy.frostchina.com/wp-content/uploads/2021/11/20211116-2.pdf

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